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怎样选择适合的荧光探针(总结)
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亲和层析纯化的抗HRP及其耦联物的抗体可以用来检测HRP或者放大含有HRP试剂的效果。哺乳动物上海金相切割机的免疫染色中。因此这个抗体的优势就是可以降低背景。由于抗HRP抗体不识别内源性的过氧化物酶的类似酶。A minomethylcoumarinAcetatAMCA 耦联的AMCA 吸收光波长最大为350nm发荧光则为450nm对于荧光金相试样切割机来说。用紫外滤板来观察。由于AMCA 信号相对较弱,AMCA 可以用汞灯来激发。单标实验中不推荐使用AMCA AMCA 和荧光素的荧光波长只有很小的重叠范围,而和发出长波长荧光的荧光基团没有或者只有极少的重叠,因此它最常用于多标记实验中,比如免疫荧光金相试样切割机和流式上海金相切割机仪。由于人眼不能很好的检测蓝色荧光,多标记的实验中,AMCA 耦联的二抗应当被用于检测大量的抗原。AMCA 和荧光素一样很快淬灭,使用抗淬灭剂可以减轻。如果使用在流式上海金相切割机仪中,AMCA 可以用汞灯或者水冷却的氩光灯激发,因为它发出的光线是光谱的紫外区。 FluoresceinIsothiocyanFITC 耦联的荧光素基团吸收的最大波长为492nm发射的最大波长为520nm由于FITC被使用了很长时间而且产量很大。因此要和抗淬灭剂一起使用。DTA F荧光素的一个衍生物,FITC被广泛应用。荧光素的最大缺点是淬灭快。激发和发射波长均和FITC相同。当和链霉亲合素耦联时,因为荧光强度上有明显的区别,最好不使用FITC而使用DTA F CyanindyeCy2.Cy5 Cy3. Cy2耦联基团激发波长为492nm发光为波长510nm绿色可见光。Cy2和FITC使用相同的滤波片。由于Cy2比FITC光下更稳定。要避免使用含有磷酸化的苯二胺的封片剂。染色片贮存后会导致荧光微弱和扩散。因为这种抗淬灭剂和Cy2反应。 背景更弱。荧光金相试样切割机的Cy3耦联基团激发光的最大波长为550nm最强发射光为570nm因为激发光和发射光波长很接近PITC,更稳定。Cy3和Cy5比其他荧光团探针要更亮。荧光金相试样切割机中,可使用和PITC一样的滤波片。 氦氖灯(543nm或者汞灯(546nm下则约75%。Cy3可以和荧光素一起作双标。Cy3还可以和Cy5一起在共聚焦金相试样切割机实验中作多标记。 Cy3氩光灯(514nm或528nm下可以被激发出50%的光强。 Cy5耦联基团的激发波长最大650nm发光波长最大670nm氪氩灯(647nm下它可被激发出98%的荧光。而且不能用汞灯作理想的激发。通常观察Cy5时采用具有合适激发光和远红外检测器的共聚焦金相试样切割机。水相封片剂中应当加入抗淬灭剂。使用保守的外表荧光金相试样切割机时,氦氖灯下(633nm为63%。Cy5可以和很多其他荧光基团一起用在多标记的实验中。由于它最大发射波长在670nmCy5很难用裸眼观察。不推荐使用Cy5 TetramethylRhodaminIsothiocyanPITC TexaRedP RhodaminRed-XRRX. RRX尤其有用,可以和Cy2或者FITC和Cy5一起使用,因为RRX发射波长在Cy2和Cy5中间,而且和这两者覆盖都很少。氪氩灯激发光为488nm598nm和647nm分别是Cy2FITC,使用RRX和P可以得到更好的颜色区分。使用装有氪氩灯的激光共聚焦扫描金相试样切割机作三标记的实验时。这些若丹明的衍生物耦联基团具有不同的吸收波长 550,570,596nm和最大发射波长(570,590,620nm尽管PITC经常和FITC一起在双标记实验中使用。RRX和Cy5理想激发波长。因为FITC和PE可以被氩灯的488nm波长激发,流式上海金相切割机仪中用FITC作双标,另一种用藻红蛋白(PE耦联基团要比若丹明好, 总结下来 荧光团探针的选择有两个重要标准: A. 荧光金相试样切割机的光源,滤片,检测系统。 B. 多标记中对探针色彩区分程度的要求。 例如,若丹明红-X (RRX)和德克萨斯红(TR)荧光素的区别就比四甲基若丹明(TRITC)或者Cy3的区别明显。 C. 灵敏度。比如,Cy3和Cy5就比其他的荧光团探针要亮。


 
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